细胞融合技术在生物医学研究中扮演着重要的角色，常用的方法包括转动法和离心法。融合过程中，脾细胞与骨髓瘤细胞的比例一般设置为1:1至10:1，其中3:1或5:1的比例最为常见。

1. 试剂与材料

(1) 供融合的脾细胞及骨髓瘤细胞。

(2) 100ml的1640培养液。

(3) 100ml的完全1640培养液。

(4) 50ml的25%FCS－1640液。

(5) 100ml的HAT培养液。

(6) 50%PEG：使用分子量4000、纯度高的PEG（日本进口或Serva），取10g放置于25ml的瓶中进行高压灭菌。使用前将其与10ml预热至40℃的1640液以等量混合，并通过酚红检测pH值，通常不需要调整。如果pH值变化，可以使用HCl或NaHCO3进行调整。

(7) 准备10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。

(8) 40孔塑料培养盘。

2. 操作步骤

⑴ 准备脾细胞。

⑵ 在50ml沉淀管中混合108个脾细胞和107个小鼠骨髓瘤细胞，加入50ml的25%FCS－1640液。

⑶ 在室温下以400g离心3分钟，使细胞沉淀。

⑷ 移除上清液。

⑸ 轻轻敲打管底，使沉淀流动，并将沉淀管置于40℃水浴中以达到融合温度。

⑹ 加入8ml预热至40℃的50%PEG，使用1ml的吸管缓慢滴加，同时摇动沉淀管，观察到颗粒出现，滴加时间保持在2分钟。

⑺ 加入1ml 1640液，继续摇动1分钟。

⑻ 重复⑺步骤一次。

⑼ 再加入1ml 1640液，边加边摇动，持续0.5分钟。

⑽重复⑼步骤一次。

⑾ 加入15ml 1640液。

⑿ 在室温下以400g离心1分钟，使细胞沉淀。

⒀ 去除上清液，轻轻敲打管底，加入25ml含有HAT的完全1640液。

⒁ 将融合的细胞液滴加到前一天培养的40孔塑料培养盘中，每孔添加1滴（约0.5ml）。

⒂ 轻轻摇动后，将其放入5% CO2饱和湿度的37℃培养箱中进行培养。

⒃ 在第3、6、9、10天更换为含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液，避免吸出固定在孔底的细胞，并根据需要补充适量的饲养细胞。

⒄ 在第12、15天加入含HAT的完全1640培养液。在每次更换培养液前，使用倒置显微镜观察，约在10天左右可以观察到杂交瘤细胞的生长。大多数杂交瘤细胞会在10~20天内出现，但也有可能在1个月左右才显现。当杂交瘤细胞出现后，需吸取上清液，检查抗体。

⒅ 对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖和传代。在传代过程中，根据情况可以取消HAT液和完全1640液，转而使用10%FCS－1640液。同时，保存细胞于液氮中并进行克隆化。此期间每代都需检查抗体，以防止抗体细胞的变异或丢失。

在使用EVO视讯的细胞融合技术，科研人员能够更有效地进行杂交瘤细胞的开发和抗体生产，推动生物医疗领域的进步。