EVO视讯人肺腺癌细胞NCI-H1975的培养指南

1. 细胞培养条件

细胞名称：NCI-H1975人肺腺癌细胞
生长特性：贴壁生长
冻存条件：无血清冻存液
培养体系：1640培养基+10% FBS
传代方法：首次传代建议比例为1:2
液体更换频率：每两天更换一次培养基
备注：使用无菌离心管收集培养基，以便作为过渡培养使用。

2. 细胞处理指南

细胞收到后应尽快处理，当细胞状态良好时，向培养瓶中添加完全培养液，并密封瓶口以确保运输安全。收到细胞后，请使用75%酒精喷洒整个瓶子以进行消毒，然后放置在超净工作台内进行无菌操作。把细胞放入37℃、5% CO2培养箱中静置3-4小时，让细胞稳定后再进行后续处理。用显微镜观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片（推荐40x、100x、200x各一张），前三天的照片将作为重要的售后依据。未提供照片的情况下，则默认细胞状态良好。注意：密封瓶口放入培养箱时，请略松盖子。建议一瓶使用原始培养基，另一瓶用自配完全培养基进行对比培养。

3. 细胞培养步骤

a. 细胞传代

若细胞汇合度未超过80%，请将培养瓶中完全培养液收集至离心管，保留5ml培养基并放入37℃、5% CO2孵箱进行培养。若细胞密度超过80%，请依据以下步骤进行传代：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁的PBS缓冲液清洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶约1-2ml至培养瓶中，放入37℃的培养箱消化1-2分钟，观察细胞变化。当细胞大多数变圆并开始脱落时，迅速轻敲培养瓶，并加入5ml以上的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后，用吸管吸出，并将悬液转移至15ml离心管中，于1000 RPM下离心5分钟，弃去上清，并加入1-2ml完全培养基重悬细胞。
4. 按1:2比例将细胞悬液分瓶传代（分至两个T25瓶），补充新鲜完全培养基至每瓶5-8ml，然后置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞覆盖培养瓶80%面积时，弃去培养液，然后用PBS清洗细胞一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，观察细胞变圆后添加5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打使其脱落。将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，加入1ml雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），轻轻混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存管直接放入-80℃冰箱。若后期需要转移至液氮罐，需在-80℃冰箱中存放至少24小时后再进行转移。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（佩戴防护面具），迅速置于37℃水浴中解冻，直至冻存管中不再出现结晶，然后用75%酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，重悬细胞于5ml完全培养基中，接种至T25培养瓶，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
4. 第二天更换为新鲜完全培养基，继续培养。

4. 注意事项

在运输过程中，某些细胞可能不牢固附着，导致细胞脱落为正常现象。请将培养瓶内所有培养液收集至离心管，进行1000 RPM离心5分钟，收集上清作为过渡培养液。沉淀后加胰酶1-2ml，轻轻吹打并重悬，消化1-2分钟后再加入5ml完全培养基终止反应。然后离心、弃去上清后，加入1-2ml完全培养基重悬。最后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新鲜完全培养基至每瓶5-8ml，再放入37℃、5% CO2培养箱中培养。

5. 售后条款

1）细胞问题的重发情况

以下情况下可重新发货：

1. 细胞在运输过程中遭遇问题（丢失、瓶身破损或培养液泄漏）将重发。
2. 如存在细胞污染，需在收到产品48小时内提供真实实验结果，经核实后重发。
3. 常温发货细胞在静置24小时后，或干冰发货细胞复苏后24小时内大部分细胞未存活，需提供细胞状态照片，将重发。
4. 干冰发货细胞复苏后24小时内或常温发货细胞静置4小时后且未开封出现污染，将重发。
5. 细胞活性问题需在收到产品7天内提供真实实验结果，使用台盼蓝染色法鉴定活力，核实后予重发。
6. 收到细胞当天及第2、3天拨打电话反馈，未反馈的视为细胞合格。
7. 如在4-7天内出现问题需提供前3天照片、出现问题时照片及详细操作步骤，经过技术人员核实确定为我方责任的，将重发。
8. 若技术人员判断为双方责任，将进行协商处理或按合同价的50%收取重发费用。

2）不予重发的情况

1. 因客户因素造成的细胞污染将不重发。
2. 客户不正确操作导致细胞状态不佳将不重发。
3. 非推荐培养体系导致的细胞状态不良将不重发。
4. 细胞状态不良且未提供前3天照片的将不重发。
5. 细胞培养时经过其它处理的将不重发。
6. 收到后2天内未反馈的，将不重发。
7. 具体情况将在个案中决定。

请在细胞培养中密切关注细胞状态，确保操作规范。使用EVO视讯提供的细胞培养指导，保障实验的顺利进行。